NGS와 qPCR의 비교

NGS 및 qPCR의 차이점

차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS)과 정량적 PCR(qPCR) 기술을 비교할 때, 가장 큰 차이점은 발견 역량입니다. 두 기술 모두 민감도 및 변이 검출의 신뢰도가 높지만, qPCR은 알려진 시퀀스만 검출할 수 있습니다. 이와 대조적으로, NGS는 시퀀스 정보에 대한 사전 지식이 필요하지 않은 접근법, 즉 가설이 필요 없는 접근법입니다. NGS는 새로운 유전자를 검출하는 발견 역량이 더 높으며 희귀 변이 및 전사물의 정량화에 대한 민감도가 더 높습니다.

NGS와 qPCR 기술은 처리량이 다르며 연구 규모의 변동에 따른 조정 가능 여부 또한 다릅니다. qPCR은 표적 수가 적은 경우에 효과적인 반면, 표적이 여러 개일 경우 워크플로우가 번거로울 수 있습니다. NGS는 표적 수 또는 샘플 수가 많은 연구에 사용하는 것이 좋습니다. 1회의 NGS 실험만으로도 수 천개의 표적 영역 전체에 걸쳐서 단일 염기 수준의 해상도로 변이를 식별할 수 있습니다.

NGS와 qPCR의 비교: 상세 비교

특정 차세대 시퀀싱(NGS) 방법은 qPCR과 비교할 때 다음이 가능합니다.

알려진 전사물과 새로운 전사물을 모두 검출
개별 시퀀스 판독을 정량화하여 상대적인 발현 값뿐만이 아닌 절대적인 발현 값 생성
유전자 발현의 미묘한 변화를 10%까지 검출
새로운 전사물, 대체 스플라이싱된 동형, 스플라이싱 부위, 작은 비코딩(noncoding) RNA를 식별
단일 assay에서 >1000개의 대상 영역을 프로파일링함

qPCR 및 표적 NGS 비교

	qPCR qPCR은 특정 위치의 특정 변이를 분석할 수 있습니다.	표적 NGS 표적 NGS는 수백에서 수천 개의 유전자를 동시에 시퀀싱합니다.
이점^1-5	익숙한 워크플로우 대부분의 검사실에서 접근 가능한 장비 사용 가능	높은 시퀀싱 뎁스로 높은 민감도가 가능함(1%까지로 낮음) 발견 역량이 높음* 돌연변이에 대한 검출 해상도가 높음† 대규모 병렬형 시퀀싱으로 고처리량 워크플로우 및 대규모 데이터세트 가능 10%까지 유전자 발현 변화 검출
과제^1-5	사전 정의된 전사물 세트에만 액세스 가능 알려진 전사물만 검출하여 발견 역량이 제한됨 제한된 처리량 및 돌연변이 해상도	적은 수의 표적에 대한 단순 검출에는 효율적이지 않음

* 발견 역량이란 새로운 변이를 식별하는 능력을 뜻함.

† 돌연변이 해상도는 식별된 돌연변이의 크기임. NGS는 대규모 염색체 재배열을 단일 뉴클레오티드 변이까지 식별할 수 있음.

변이를 식별하는 데 있어 hit-and-miss 방식의 유전자 연관성 연구가 적중률이 낮다는 게 분명해졌습니다. 이러한 연구들은 무작정 낚시 바늘을 던지는 것이나 마찬가지였습니다. NGS를 통해 유전체(genome)의 더 많은 부분을 동시에 살펴볼 수 있다는 것을 깨달았습니다.

Linda S. Pescatello 박사
(Connecticut 대학교, 운동학 석좌 교수)

RNA-Seq과 qPCR의 장점 비교

qPCR은 몇 가지 유전자의 발현을 정량화하는 데 유용하지만, 알려진 시퀀스만 검출할 수 있습니다. 반면에 NGS를 사용한 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)은 알려진 전사체와 새로운 전사물을 모두 검출할 수 있습니다. RNA-Seq은 미리 설계된 프로브가 필요하지 않으므로, 데이터 세트가 편향되지 않아 가설이 없는 실험 설계가 가능합니다.

qPCR 대비 RNA-Seq의 주요 장점:

새로운 전사물 검출을 위한 발견 역량 향상
희귀 변이 및 저발현 유전자 검출을 위한 민감도 향상
여러 샘플에서 여러 유전자의 동시 시퀀싱을 위한 고처리량 증가
배경 잡음이나 신호 포화 없이 유전자 발현을 정량화할 수 있는 더 넓은 동적 범위

NGS 또는 qPCR은 언제 사용해야 하나

NGS와 qPCR 중 어느 것을 선택할지는 샘플 수, 표적 영역의 시퀀스 총량, 예산과 관련된 고려사항, 연구 목표 등을 포함한 여러 요인들에 달려있습니다. 일반적으로 표적 영역의 수가 적고(표적 20개 이하) 연구 목표가 알려진 변이의 선별 또는 식별로 제한되는 경우에는 qPCR이 좋은 선택이 될 수 있습니다.

그 외에는 NGS가 요구 사항에 적합할 가능성이 더 높습니다. 여러 샘플 전체에 걸쳐서 여러 유전자의 시퀀스를 동시에 분석할 수 있는 표적 NGS 방법을 사용하면 기존의 반복적인 방법에 비해 시간과 리소스를 아낄 수 있습니다. 또한 NGS는 발견 역량이 더 높으므로 새로운 변이의 검출 가능성이 높습니다.

비디오 보기: qPCR 대신 NGS 사용

qPCR에서 NGS로 전환하기

MiSeq® System을 사용하면 차세대 시퀀싱의 역량을 한층 더 쉽고 낮은 비용으로 검사실에 도입할 수 있습니다. 시퀀싱이 완료된 후, Correlation Engine과 같은 도구들을 사용하여 이전 qPCR 데이터를 NGS 데이터와 비교할 수 있습니다.

준비

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시퀀스

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작은패널용: 표적 재시퀀싱, 메타지노믹스, 작은 유전체 시퀀싱, 표적 유전자 발현 프로파일링 등.

NextSeq 1000 및 2000 시스템

대형 패널용: 표적 시퀀싱, RNA-Seq, 단일세포 방법, 엑솜 시퀀싱 등.

벤치탑 시퀀서

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참고 문헌

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Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009;10:57-63.
Myllykangas S and Hanlee JP. Targeted deep resequencing of the human cancer genome using next-generation technologies. Biotechnol Genet Eng Rev. 2010; 27: 135–158.
Illumina. High-impact discovery through gene expression and regulation research. https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/gated/gene-expression-profiling-e-book-web.pdf. Accessed March 23, 2023.
Illumina. Advantages of next-generation sequencing vs qPCR. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/ngs-vs-qpcr.html. Accessed May 22, 2023.

NGS와 qPCR의 비교